降低水力停留时间至20h，待其稳定运行，出水COD的去除率稳定在80%时，观察厌氧反应器内厌氧颗粒污泥情况。经过分析，制备的厌氧颗粒污泥要以甲1烷八叠球菌类型为主，同时存在少量丝状菌与杆1菌，外观直径以2-3mm为主。通过判断，厌氧反应器内厌氧颗粒污泥的二次培养成功。继续运行3个月，厌氧反应器COD去除率稳定(达90%以上)，无任何酸化等现象， 产气量及组分均很稳定，运行正常。
温度对于UASB的启动与保持系统的稳定性具有重要的影响。UASB反应器在常温(25℃)，中温(33℃～41℃)和高温(55℃)下均能顺利启动，并形成颗粒污泥。但绝大多数UASB启动过程的研究都是在中温条件下进行的，也有少数低温启动的报道。另外，不同种群产甲1烷菌对生长的温度范围，均有严格要求。因此，需要对厌氧反应的介质保持恒温。不论何种原因导致反应温度的短期突变，对厌氧发酵过程均有明显的影响
pH值是厌氧处理的又一个重要因素。厌氧过程中 ,水解菌与产酸菌对 pH有较大的适应范围 ,而甲1烷菌则对pH值比较敏感 ,适宜它的生长范围是6.5～7.8。若反应器内废水pH值超过这个范围 ,会引起由于甲1烷菌受到抑制而出现的酸积累等问题 ,因而甲1烷菌的这一特性也就决定了反应器内反应区所应控制的pH值范围。反应器内乙1酸的形成是对pH值影响大的一个因素。