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microRNA芯片:

RNA干扰(RNA Interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御或外来病毒qin犯的防御机制。将含有靶基因mRNA同源互补序列的RNA（Double strand RNA， dsRNA）导入细胞后，能够特异地识别该mRNA，引起mRNA的降解，从而导致相应的功能缺失。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了smallRNA的信息，所以需要另外再构建一个smallRNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他smallRNA的鉴定及注释信息。RNAi提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性疾病及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、 shRNA和siRNA等。

MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节基因表达的内源性小RNA，人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同，由于miRNA具有内源性，因此其更易产生有效的基因沉默。

技术流程：

dsRNA或pre-miRNA被导入细胞后，能够被一种特异的核酸内切酶（Dicer）识别并切割成为小片段，这些片段在RNA解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），RISC与mRNA同源区进行特异性结合，若miRNA与mRNA的结合位点配对，则切割mRNA；若miRNA与mRNA的结合位点不配对，则抑制mRNA的翻译。高l效液相色谱(High-performanceLiquidChromatography,HPLC)HPLC是--种比较传统的方法,是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。

线粒体测序

线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着至关重要的作用。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、疾病诊断等学科领域。线粒体全基因组在生物进化的研究中具有的优势。分子实验介绍——荧光定量PCR检测荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息，同时，相对于核基因组，线粒体基因组小，容易对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的钟爱。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即核酸序列组成和基因组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以很好的互补。

高l效液相色谱法检验方法

高l效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不相同的。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。

高l效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反.应，方能进行分离或检测。他们的结果表明，NimbleGen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台，尽管覆盖了较少的基因组区域，但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也少。常用的色谱柱填充剂有硅胶用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中常用的是十八烷基硅l烷(又称ODS)键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。

7.如何检测引物的纯度？

答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。结束反应,PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

而有的厂家提供Maldi-TOF质谱QC质量控制，从而保障了合成的准确率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF质谱仪进行全自动装载及监测。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。用预先固化在beads上的蛋白质A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来，再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。Bioneer是世界上仅有的几个对生产的每份核苷酸 (单个寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF质谱仪检测进行核苷酸QC检测的厂商，而且免费提供质谱数据。

8.如何计算引物的浓度？

答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.